Açıklama
Geliştirilmiş genetik veya işlevli mutantlar üretin.
Patogenez, toksisite, biyofilm gelişimi ile ilgili genleri tanımlar.
Metabolik yolları açın.
Gerekli genleri ve düzenleyici öğeleri tanımlar.
Yeni genleri ve gen fonksiyonlarını karakterize eder.
Kan seçilebilir markörünü, pir gen ürününü eksprese eden E. coli konakçıdaki gDNA’ya ve kurtarma klonlarına yerleştirin.
Uygulamalar ve Yararları
Uygulamalar
Transpozon-mutajenize mikrobiyal genlerin kurtarma klonlanması (Şekil 1).
Plasmidlerin E. coli olmayan bakterilerden kurtarılması.
Transpozon mutagenezinin avantajları arasında transpozonun, parçalanmış olan genomik DNA bölgesini klonlamak ve dizilemek için kullanılabilen bir işaretleyici olarak görev yapmasıdır. Hiçbir şey bu klonlama işlemini EZ-Tn5 ™ <R6Kγori / KAN-2> Tnp Transposome ™ Kiti ile in vivo mutasyonlar oluşturmak kadar kolaylaştırmaz. Geniş bir konakçı kanamisin direnç genini kodlamaya ek olarak transpozon bir E. coli içerir. replikasyonun koşullu kökeni (R6Kγori). Bu replikasyon kaynağının varlığı, içine transpozonun yerleştirildiği genomik DNA veya plazmid bölgesinin yayılmasını veya “kurtarılmasını” mümkün kılar.
İlk önce Transposom’u mümkün olan en yüksek transformasyon verimliliğinin elektro-uyumlu hücrelerine elektroporate edin. Transpozomun hücre içinde Mg2 + ile aktivasyonu, EZ-Tn5 <R6Kγori / KAN-2> Transposonunun konakçının genomik DNA’sına rastgele sokulmasıyla sonuçlanır. Kanamisin plakaları üzerinde transpozisyon klonları veya gen fonksiyonu kaybı için tarama yaparak seçin.
Yararları
E. coli‘de normal olarak kopyalanmayacak olan çeşitli bakteri türlerinden plazmidleri kolayca geri kazanın ve çoğaltın.
Mutagenize genlerin basit kurtarma klonlaması süreci, yapı / fonksiyon çalışmaları ve dizilemeyi hızlandırır.
Transpozon DNA’nın rastgele yerleştirilmesi, tüm bakteriyel kromozomun mükemmel bir şekilde kaplanmasını sağlar.
Kurtarma klonları, transpozonun uçlarına homolog olan primerler kullanılarak çift yönlü olarak sekanslanabilir.
