Sıkça Sorulan Sorular

Anasayfa / Sıkça Sorulan Sorular

 

PCR & Amplification

FailSafe PCR sistemi, PCR amplifikasyonları için optimum şartlar tek bir PCR döngüsüyle otomatik olarak belirlenerek, özellikle zor PCR problemlerini çözmesi açısından benzersiz bir sistemdir. PCR PreMix Selection Kit’imiz 12 farklı buffer, deoxyribonucleotides , tuz, magnezyum tuzunun değişik varyasyonlarını ve Betainli FailSafe PCR Enhancer içeren PCR Premix kullanarak tamamen başarılı bir şekilde hatasız sonuç elde etme garantisi verir. Araştırmacılar, ellerindeki primer setleri ile hedef bölge için 2x Premix’i kullanabilecektir.

İlk kez spesifik bir primer / template kombinasyonu kullanılıyorsaniz, PCR reaksiyonlarinizi 12 adet FailSafe PCR PreMixlerinden herbiriyle hazırlayabilirsiniz. Daha sonra her bir PreMix reaksiyonunuzdan elde ettiğiniz PCR ürününü agaroz jel elektroforez ile analiz edebilir, görsel olarak hangi PreMix’in en iyi amplifikasyonu verdiğini (istenilen uzunlukta tek bir güçlü PCR eldesi)kolaylıkla belirleyebilirsiniz. Daha sonra seçtiğiniz PreMix’i karar verdiğiniz primer/template kombinasyonunu kullanarak bundan sonrakı uygumalarda kullanabilirsiniz.

Ürünümüzü ‘FailSafe’ olarak isimlendirdik, çünkü 12 adet FailSafe PreMix’den en azından bir tanesi size istediğiniz ürünü verecek şekilde tasarlanmıştır. Optimizasyon otomatiktir. Bu optimizasyon için gereki olan süre en iyi PCR PreMix’e emin olmak için gereklidir ve genellikle 6 saatten azdır.

Evet. FailSafe PCR sistemi alışılmışın dışında floresan problar (TaqMan/Scorpion, etc ..) ile rahatlıkla kullanılabilir. SYBR Green Real-Time PCR için, son kullanıcının kendi SYBR Green I Dye’ ını PreMix’lere uygun konsantrasyonda eklemesı gereklidir. Real-time cihazlarda kullanılması için ayrı bir ROX tüp referans standard olarak sağlanabilir.Real-time deneylerde optimizasyon prosedürü tıpkı standard FailSafe PCR sistemlerindekinin aynısıdır – böylelikle basitçe her bir real-time PCR Mix’i kullanarak, en düşük eşik dönğüsü (Lowest threshold cycle-CT) ve en iyi erime eğrisine bağlı olarak en uyumlu PreMix’I seçebilirsiniz.

FailSafe PCR Enzyme Mix patentli thermostable (ısıya karşı dayanıklı) DNA polimerazlarin bir karışımıdır ve hatalari düzelten bir özelliği vardır. Enzimlerin bu karışımı mükemmel bir PCR verimliliği sağlar ve sadece normal Taq DNA Polimeraz kullanan sistemlere göre çok daha yüksek doğruluk verip hatta en zor DNA örneklerinin çoğaltılmasına olanak sağlar. DNA örneklerinin kaynağına ya da özelliklerine bakmaksızın, bu enzim karışımı içerdiği yüksek GC bileşeni ile DNA’ları verimli bir şekilde kolayca çoğaltır.

Evet. FailSafe PCR Sistemi 3 farklı amplifikasyon ürün tipi verir; bunlardan ikisi klonlamaya uygundur.

Bu ürün tipleri:

  • PCR products with non-template A’s : Her iki uçta üretilen ve TA klonlama uygulamalarında T vektörler kullanan ürünler. Ayrıca Topo-TA klonlama ile kullanılabilen ürünler.
  • PCR products with blunt ends on both ends : Bu tür ürünler sadece uygun bir vektöre blunt-end klonlama yapılabilir.
  • PCR products with non-template A on one end and a blunt end on the other: PCR ürünlerinin çeşit oranı kullanılan template’e bağlı olarak değişiklik göstercektir ve bu yüzdendir ki PCR reaksiyon tiplerini ürettiği PCR ürününe göre birini diğerine göre favori/özel kılacak bir geçerli bir klavuz söz konusu değildir.

Hangi FailSafe PCR PreMix’in, seçilmiş template/primer kombinasyonu ile en iyi çalışacağını deneyimlemeden kesin ve net söylemek neredeyse imkansızdır. En iyi optimizasyon için bütün PreMix’lerin kullanılmasını şiddetle tavsiye ediyoruz. Eğer sadece seçilmiş PreMix’ler ile test yaparsanız, belli bir amplicon için optimum şartları gözden kaçırma riskine girmiş olursunuz ve bu size, yanlışlıkla reaksiyonunuz için aslında hiç de optimal olmayan PCR ortamını hazırlatmış olur. Bu durumdan kaçının ve deneylerinizde boşuna vakit ve emek kaybetmeyiniz.

FailSafe 20 kb uzunluğundaki template’leri çoğaltabiliyor. 10 Kb’den büyük template’ler için 2.5 units FailSafe PCR Enzim Mix kullanılmasını tavsiye ediyoruz. 10 Kb’den küçük template’ler için de 50-μl reaksiyonlarda 1.25 units tavsiye ediyoruz.

MasterAmp Extra-Long PCR kiti 20Kb den büyük 40 Kb’ye kadar olan uzunluktaki örnekleriniz için ideal kitimizdir.

FailSafe Enzim Mix’in doğruluğu yaklaşık olarak Taq Polimeraz’a kıyasla 3 kat daha iyidir. Bu demek oluyor ki; Taq Polimeraz doğruluğu ortalama 9000 bases da 1 iken FailSafe replike doğruluğu 27,000 ile 30,000 de 1’dir. Pfu, Pwo ya da Phusion gibi digger proofreaderlar gibi iyi olmasa da, herhangi bir dizileme cihazında sekanslanacak RNA-Seq ya da DNA-Seq kütüphaneleri için çok kolay bir şekilde yeterli bir değerdir.

 

LAMP & Isothermal Amplification

LavaLAMP™ Master Mixes DNA hedef bölgeleri için optimize edilmiştir. RNA’lar için çalışabilirliği olup bu uygulamayı desteklicek şu aşamada yeterli veri bulunmamaktadır.

Her bir target için 6 primerlik bir set (FIB, BIP, Loop-F, Loop-B, F3 ve B3) tasarlamanız gerekiyor.
Bu konuda sizlere yardimci olsun diye online olarak ücretsiz Eiken Primer Explorer uygulamasını öneriyoruz. Ya da bu procese yardımcı olması için LAMP Designer software satın alabilirsiniz. Yeni bir assay geliştirirken, optimum seti belirlemek için primerlerin çoklu setlerini karşılaştırmayı tavsiye ediyoruz.

Evet. FIB, BIP, F3 ve B3 primlerlerini kullanabilirsiniz, bunun sonucunda assay daha yavaş olacaktır ve yüksek ihtimalle hassasiyetten taviz vermiş olursunuz.

Evet. Syto-13 (Molecular Probes) ve EvaGreen her ikisi de LavaLAMP DNA Master Mix ile Arge’mizde test edilmiş ve oldukça iyi performansda çalıştığı izlenmiştir.

Evet. O yüzden Dye’ı reaksiyon mix’e ekleyiniz ve hemen reaksiyonu çalıştırınız.

Hayir. Ön ısıtma,input olarak saflaştırılmış target kullanıyorsanız reaksiyonu hızlandırabilirsiniz ve bu da size daha düşük sonuca ulaşma süreleri ( lower time to result – TTR) sağlar.

Kontrol template 25,000 copies/ µL ya da 0.10 pg/µL içerir ve doğrudan herhangi bir seyreltme hazırlamaya ihtiyaç olmadan kullanılabilir.

Hayır. Preheat(ön-ısıtma) aşaması max 90°C ya da küçük olacak şekilde max 5 dakkaya kadar gerçekleştirilmelidir.

Evet. Ama,assay spesifik performans, sample spesifik kısıtlamadan etkilenebilir. Bu yüzden assay, işlenmemiş sample’lar ile gerçekleştirilmeden önce, ilk once saflaştırılmış DNA target’ları ile test edilip geliştirilmesi gerekir.

Evet. LavaLAMP Master Mixes oda sıcaklığında bile bütün gece stabil şekilde bozulmadan kalabilirler.

Evet. LavaLAMP Master Mix liyofilizasyonu mümkün kılacak şekilde formulize edilmiştir. Spesifik liyofilizasyon parametreleri için liyofilizasyon vendorunuza danışınız lütfen.

Amplifikasyon sonrasi ürünler, reaksiyonu agaroz jel uzerinde izleyerek ya da reaksiyonun türbiditesini OD600 da ölçerek monitor edilebilir.

Bu yapi normaldir ve LAMP reaksiyonu esnasında üretilen birçok döngüsel konkatemeri göstermektedir.

Zayıf primer tasarımı. 6 primer setini tasarlarken online yazılım kullanın. Bütün primer tasarımları başarılı olacak diye bir şey yoktur bu yüzden multiple primer setlerini en iyi sonucu elde etmek için test ediniz.

PCR ve Bst DNA Polimeraz reaksiyon ortamı hazırlanılma ihtimaline karşı, belirtelim ki bu ortamlar LavaLAMP™ DNA Master Mix icin uygun değildirler.

Eğer Primer konsantrasyoları ve oranları yanlış ise:

LAMP Primer Mix, 10X olması gereken değerleri:

    1. 16 µM for each FIP and BIP primer
    2. 8 µM for each Loop-F and Loop-B primer
    3. 2 µM for each F3 and B3 primer

Eğer örnekler çok kirli ve kompleks ise:

Kontaminasyonlar reaksiyonu kötü yönde etkilemiş olabilir. DNA’yı saflaştırıp örneği dilüe ediniz.

           Eğer cihaz üzerinde yanlış flüoresan ayarları seçilmiş ise:

Fluorimetre üzerindeki FAM kanalını kullanınız.

Evet. Real-time assay tercih edilendir çünkü, reaksiyon ilerlemesi hem target örnekleri için hem de NTC örnekleri için kolaylıkla monitor edebilirsiniz.

ΔTTR target ve primer seti bağımlıdır. Genellikle, en düşük hedef konsantrasyonunu kullanarak güvenilir bir şekilde TTR farkını yakalayabilirsiniz. Sampe ve NTC arasındaki ΔTTR en azından 5 dakika olmalıdır.

Kontrol reaksiyonu en iyi şekilde 74°C’de kit olarak sağlanmış DNA Positive Control LAMP Primer Mix ile optimize edilmiştir. Her bir örnek başarılı bir amplifikasyon için benzersiz ve uygun şekilde tasarlanmış target spesifik primerler ve optimal sıcaklık gereksinimi duyar. Reaksiyon sıcaklığının yeni target ve primer setleriyle optimizasyonu, performansi maksimize etmek için doğru şekilde yapılmalıdır.

Reaksiyon çok uzun sürede gerçekleşmiş olabilir ve arka plandaki NTC sinyali bu sürede maksimum sayıda sample sinyali yakaladı. Bu da yüksek ihtimalle primer ikizleşmesi(dimerization) ya da non-spesifik primer tavlaması(annealing) ve uzatma (extension) olaylarından kaynaklanmıştır.

QuickExtract™ Plant DNA Extraction Solution

Bitki dokusunu parçalamak ve PCR uygulamaları için genomik DNA’yı ekstrakte etmek için tasarlanmış bir reaktif karışımıdır. QuickExtract prosedürü, bitki dokularının donma, öğütme veya boncuk atma ihtiyacı olmaksızın numuneyi ekledikten sonra iki basit ısıtma adımını içerir. Bu ısıtma adımları, RNA ve birçok protein gibi diğer hücresel bileşenleri yok ederken, PCR için bozulmamış genomik DNA’yı hazır bırakır. Prosedür tüm PCR inhibitörlerini inaktive etmese de, numunenin seyreltilmesi çoğu amplifikasyon prosedüründe etkilerini en aza indirir.

Hayır. CTAB bazlı yöntemler ve spin kolonları, yüksek seviyelerde polifenolik bileşikler ve polisakaritler içeren DNA ile sonuçlanabilir. Bu kirletici maddeler, PCR’de kullanılan birçok tipte termostabil DNA polimerazını inhibe edebilir. QuickExtract Plant DNA Ekstraksiyon Çözeltisi, polifenolik bileşikleri ve polisakaritleri zenginleştirmez, bu da, ekstraksiyona tabi tutulan DNA’nın PCR bazlı analizler için uygun hale getirilmesini sağlar.

Hayır. Çıkarılan DNA, PCR ile verimli bir şekilde çoğalır, ancak ekstraksiyon prosedürü proteinleri ve diğer hücresel kalıntıları gidermez; bu nedenle, DNA enzim kesimi veya klonlama için kullanılamaz. . Bununla birlikte, spesifik bir genomik DNA hedefinden amplifiye edilerek ortaya çıkan PCR ürünü saflaştırılabilir, enzim kesimine maruz bırakılabilir veya klonlanabilir.

Pirinç, buğday, mısır, soya fasulyesi, biber, biberiye, üzüm, ıspanak, asma yaprağı ve Arabidopsis gibi çok çeşitli bitki türlerinden DNA elde etmek için başarıyla kullanılmıştır. Araştırmacılar ayrıca solüsyonu alg [1], liken [2], yosun [3] ve Botrytis [4] gibi bitkileri enfekte eden mantarlarla kullandıklarını bildirmişlerdir.

Evet. Çıkarılan DNA, Polimorfik DNA’nın rastgele amplifikasyonu (RAPD), kısa-tandem tekrar analizi (STR), tek nükleotid polimorfizmi analizi (SNP) ve gerçek zamanlı PCR yöntemleri dahil, PCR tabanlı bitki genotipleme yöntemleri için idealdir.

Hayır. QuickExtract Plant DNA Ekstraksiyon Çözeltisiyle izole edilen genomik DNA, PCR dışındaki prosedürler için uygun olmayan safsızlıklar içerir. Sıralama kütüphaneleri hazırlanmadan önce daha fazla temizleme gereklidir.

Ekstre edilmiş DNA ile PCR başarısızlığının en yaygın nedeni, yaprak dokusunun uygunsuz kullanımıdır. Yaprak dokusunu öğütmemeye özen gösterilmelidir, çünkü bunu yapmak, PCR’yi inhibe eden yüksek seviyelerde polifenoller salabilir. QuickExtract çözümünü yaprak zımbalarına ekleyin ve teknik kılavuzda açıklandığı gibi ısıtma adımlarını izleyin. Daha fazla PCR amplifikasyonu optimizasyonu, FailSafe ™ PCR PreMix Seçim Kiti (Lucigen Kat. No. FS99060) kullanılarak gerçekleştirilebilir.

Numunede artık bozulmuş RNA bulunduğundan, DNA’yı nicelleştirmek için spektrofotometrik yöntemler (örneğin A260) kullanılarak, DNA konsantrasyonunun yapay olarak yüksek bir tahmini elde edilir. DNA’yı nicelemek için en iyi yöntem, Hoechst 332581 (bisbenzimit) veya PicoGreen® boyası (Thermo Fisher Scientific) gibi DNA’ya özgü bir boya kullanılarak florimetredir. Bu boyalar, nükleotidlere, tek iplikli DNA’ya veya RNA’ya değil çift iplikli DNA’ya spesifik olarak bağlanır.

QuickExtract™ RNA Extraction Kit

Kit, hücreleri saflaştırmak ve reverse-transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) uygulamaları için RNA’yı daha fazla saflaştırma aşaması olmaksızın elde etmek üzere tasarlanmış bir reaktif karışımı içerir. QuickExtract prosedürü, hücreleri parçalamak ve RT-PCR amaçlı RNA’yı serbest bırakmak için basit bir vortex-karıştırma aşamasından oluşur. Kit, genomik DNA’yı indirgeme amaçlı isteğe bağlı bir adım olarak DNase I ve ilgili reaktifleri içerir. Çıkarılan RNA hem end point hem de gerçek zamanlı RT-PCR için uygundur.

Kit, kültür edilmiş veya primer hücrelerle kullanım için idealdir. Çeşitli insan, fare ve sıçan kültürleri dahil süspansiyon ve yapışık hücre hattı kültürlerin yanı sıra, insan yanak hücreleri, E. coli ve S. aureus ile test edilmiştir. Araştırmacılar ayrıca kiti Drosophila hücre hatlarında [1], fare tat tomurcuk hücrelerinde [2], H1N1 ile enfekte olmuş domuzların nazal bezlerinde ve [3] ve V. fischeri’de [4] kullanmışlardır.

Hayır. Kit, kültürlenmiş veya birincil hücrelerle kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Doku örnekleri optimal sonuç vermeyecektir; MasterPure ™ Complete DNA ve RNA Saflaştırma Kitini kullanarak doku örneklerinden RNA’yı saflaştırmanızı öneririz (Lucigen Kat. No. MC89010, 5 reaksiyon; veya MC85200, 100 reaksiyon).

Evet. Çıkarılan RNA, 1 yıla kadar –80˚C’de saklanabilir. Donma-çözülme döngüleri miktarını en aza indirmek için, ekstrakte RNA’yı saklamadan önce küçük alikuotlar halinde bölün.

Eğer SYBR® Green gibi boya bazlı tespit yöntemleriyle gerçek zamanlı RT-PCR’de kullanılacaksa, DNase I ile ekstre edilmiş RNA’yı kullanmanızı öneririz. Mümkünse, DNase I uygulamasının gerekli olmaması için PCR primerleri tasarlayın. Örneğin, uzun bir intronu kuşatan ve kısa döngü süreleri kullanan primer bölgeleri seçin. Bu koşullar altında, kısa cDNA dizisinin amplifikasyonu, daha uzun genomik DNA dizisinden daha fazla tercih edilecektir.

Kantitatif RT-PCR’nin duyarlılığı, kullanılan örnek miktarına ve saptanan mRNA’nın anlatım seviyesine bağlı olacaktır. HeLa hücrelerinde, orta derecede eksprese edilen bir mRNA için beş hücre kadar az ile başlayarak iyi sonuçlar elde ettik.

In Vitro Transcription

Epicenter’da 9 kb’lik transkriptleri test ettiğimiz ve hazırladığımız halde araştırmacılar 11 kb’den daha yüksek kalitede transkriptler bildirmektedirler.

Daha düşük DNA örneği konsantrasyonları ile, kullanılan kalıp miktarına bağlı olarak, önerilen 30 dakikadan 2-4 saate kadar reaksiyon süresini artırarak RNA verimlerini arttırabilirsiniz. Reaksiyon sıcaklığının 37 ° C’den 42 ° C’ye yükseltilmesi de verimi arttırır.

Standart bir 20 µl’lik reaksiyondaki reaktiflerin bileşenleri, çözünürlük sınırlarına çok yakındır. Reaksiyonu buz üzerinde ayarlarsanız, bazı reaksiyon bileşenleri (tampon ve nükleotidler gibi) çöker. Bileşenler çöktükten sonra, reaksiyon tüpünün ısıtılması sadece reaktifleri kısmen çözer. Son olarak AmpliScribe T7-Flash Enzim Çözeltisi eklenir, bu nedenle gerekli olana kadar buzda tutulabilir.

Çok temiz örnek DNA’sı, in vitro transkripsiyon reaksiyonunun en iyi performansını sağlar. Kalıp olarak bir PCR ürünü kullanılıyorsa, kalan tüm primerleri, primer-dimerleri ve artık dNTP’leri ortadan kaldırmak için reaksiyondan istenen ürünü saflaştırın. Kalıp için bir plazmid kullanıyorsanız, istenen RNA ürününü transkribe etmek için, plazmiti bir küt veya 5′ ucu bırakarak tamamen lineer forma getirin. Kesilmemiş plazmid mükemmel kalıp olarak görev yapar, ancak RNA polimeraz istenen transkripsiyon durdurma noktasının ötesine transkribe olur ve reaksiyonun sonlanmasından önce plazmidin etrafında birkaç kez devam edebilir, arzu edilenden çok daha uzun bir RNA oluşturur ve istenmeyen vektör dizileri içerir.

AmpliScribe T7-Flash Transkripsiyon Kiti ile 26 baz RNA transkriptleri üretilmiştir.

Evet, transkriptlere doğrudan türevlendirilmiş nükleotidleri (Cy5, biyotin veya digoksigenin gibi parçalarla) birleştirebilir veya saflaştırılmış RNA transkriptlerinin 5′ veya 3′ uçlarından transkripsiyon sonrası işaretlenmesini gerçekleştirebilirsiniz.

AmpliScribe T7-Flash ™ Kit’in avantajları şunlardır: a) AmpliScribe High-Yield Transkripsiyon Kitleri ile elde edilen mükemmel sonuçlardan bile daha verimli RNA eldesi; ve b) 30 dakikalık hızlı bir prosedür olmasıdır.

Evet, ama tavsiye edilmez. Nadiren de olsa, transkripsiyon sonrası işaretleme kullanılarak radyoaktif problar yapılabilir. İn vitro transkripsiyon reaksiyonu sırasında radyoaktif RNA üretilmesi, yüksek spesifik aktiviteye sahip problar hazırlamak için gereken yüksek konsantrasyonlarda radyoaktif NTP’ye bağlı olarak bir çok radyoaktif nükleotit gerektirir. Bu son derece pahalı ve potansiyel olarak tehlikelidir. Bir 5′-hidroksil ucu oluşturmak için alkali fosfataz kullanarak radyoaktif RNA probları hazırlayabilir, ardından γ-32P-ATP ve T4 Polinükleotid Kinaz kullanarak radyoaktif işaretleme yapabilir veya a-32P- (5´, 3´) -bisfosfat kullanarak NDP’ler ve T4 RNA Ligazı kullanılarak RNA’nın 3 ‘ucuna bağlama yapılabilir..

In vitro transkripsiyon için başarılı hibrit şablonları bildirilirken, AmpliScribe ve DuraScribe kitleri kullanılarak RNA kopyalanmasında en iyi sonuç için tam çift şeritli şablonlar kullanılmalıdır.

DuraScribe T7 Transkripsiyon Kiti, bir 2 ‘riboz florine sahip nükleotitleri içeren ve A-tipi RNazlar (insan cildinde bulunan RNaz gibi) ile bozunmaya dirençli olan RNA’ları üretirken, AmpliScribe T7-Flash ve diğer transkripsiyon kitleri standart RNA yapar. DuraScript ™ RNA, normal RNA gibi reverse-transkribe edilebilir ve RNaz III ile parçalanabilir. Ancak, DuraScript RNA, in vitro translasyon ile protein üretmek için bir kalıp olarak kullanılamaz.

AmpliScribe reaksiyonu ayarı sıcaklığa duyarlıdır ve reaksiyon için soğuk reaktifler kullanırsanız verim kaybı oluşabilir. Enzimler de dahil olmak üzere tüm bileşenler, çökelti oluşumunu en aza indirmek için oda sıcaklığına getirilmelidir. Reaksiyonunuzu ayarlarken çökeltiler oluşursa, yeniden çözme işlemi tamamlanmamış olabilir. Bu downstream RNA verimini etkileyebilir. Verilerin kit spesifikliğinde olduğunu teyit etmek için kontrol örneğini kullanarak bir in vitro transkripsiyon reaksiyonu yapılmasını öneriyoruz.

Başarılı AmpliScribe reaksiyonları, beyaz bir çökelti oluşmasına neden olabilir. Bu çökelti, reaksiyondan sentezlenmiş RNA’dır – verim, RNA çözeltiden çökeltecek kadar yüksek olabilir. Endişelenmeyin – reaksiyonu sadece RNaz içermeyen su ile seyreltin ve önerilen metotlardan herhangi birini (amonyum asetat çökeltme, döndürme kolonu veya etanol çökeltmesi) kullanarak saflaştırın.

AmpliScribe ve DuraScribe reaksiyonlarını yıkamak çok basittir. Üç yöntem tavsiye ediyoruz:

Spin kolon

Tuz çökeltmesi (100 bazdan uzun RNA transkriptleri için etanol içermeyen amonyum asetat kullanılarak)

Fenol kloroform veya etanol çökeltisi

Ne yazık ki, bu özel olarak kabul edilir. AmpliScribe T7 Polimeraz çözeltisi, transkripsiyonu arttıran katkı maddeleri içerir, bu nedenle AmpliScribe reaksiyonu başına birim sayısı, saf T7 RNA Polimeraz ile reaksiyon başına kullanılan birim sayısıyla karşılaştırılamaz.

Tek iplikli in vitro transkriptler, denatüre edici jeller kullanılarak en iyi şekilde ayrılır. Denatüre edici jeller, in vitro transkriptlerin, uzunlukları + ikincil yapılarına dayanmak yerine uzunluklarına göre ayırmalarına izin verir. Doğal jeller kullanıldığında, örnek migrasyon transkriptlerde ikincil yapılar tarafından değiştirilebilir.

Hayır. Elektroforezinizin doğal bir jel üzerinde gerçekleştirilmesi olasıdır, bu da RNA’dan herhangi bir ikincil yapıyı uzaklaştıramaz. RNA’dan herhangi bir ikincil yapıyı uzaklaştırmak için elektroforez için denatüre koşullarını kullanın ve RNA’nın smear yerine sıkı bir bantta hareket etmesine izin verin

Next Gen Sequencing

Enzimatik fragmentasyon reaksiyon karışımı doğrudan Uç-onarım / A-Tailing Reaksiyonunda (temizleme veya tampon değişimi yok) kullanıldığı için, DNA kaybı olmaz. Bu nedenle parçalanma reaksiyonlarınız 50 ila 75 ng DNA arasında ayarlanmalıdır.

Diğer parçalanma enzimleri kullanabilirsiniz, ancak sindirim olmadan doğru boyutta parçalar üretmek için parçalanma reaksiyonlarını optimize etmeniz gerekebilir. Protokolü uygularken enzimatik fragmantasyonu durdurmak için EDTA kullanmayın. Yüksek EDTA konsantrasyonu, parçalama reaksiyonu ilerlemeden önce temizlenmedikçe bir sonraki uç onarım / A-kuyruk reaksiyonunu engelleyecektir.

Hayır. DNA saflaştırması için özel bir tavsiyemiz yoktur. Bununla birlikte, saflaştırılmış DNA 1.8’in üzerinde A260 / 280 oranları ile yüksek kalitede olmalıdır. DNA ayrıca saptanabilir RNA kontaminasyonu içermemelidir. Kesme / parçalanma işleminden önce, saflaştırılmış DNA numuneleri, örnek bozulmasını ve RNA kirlenmesini kontrol etmek için% 0.7 agaroz jeli üzerinde analiz edilebilir.

Yukarıda belirtildiği gibi, enzimatik parçalanma reaksiyonunuzda en az 50 pg DNA kullanabilirsiniz. Uç onarım / A-Tailing Reaksiyonu için giriş DNA’sının maksimum hacmi 12.3 µL olduğundan, sindirilmiş DNA’nız ≥4.1 pg / µL konsantrasyonda olmalıdır.

DNA miktarını ölçmek için Qubit® kullanmanızı öneririz. Bununla birlikte, hem viskozitesi hem de küçük hacimleri doğru bir şekilde pipetlemenin zorluğu nedeniyle, yüksek moleküler ağırlıklı genomik DNA’nın ölçülmesi zordur. Doğru bilginin elde edilmesi için, mümkünse, DNA’nızın kesilmesinden sonra yeniden nicelendirilmesini öneririz.

Qubit® gibi floresan dsDNA bağlayıcı boya sistemlerini kullanarak düşük DNA konsantrasyonunu doğru olarak belirlemek zordur. Numuneniz, bu tür bir nicelendirmeye uygunsa (ör., tek bir tür) qPCR kantitasyonu başka bir seçenektir. PCR amplifikasyonundan sonra, Bioanalyzer üzerindeki son kütüphane boyutunu analiz ederek ve Illumina dizileme işlemine başlamadan önce Qubit® tarafından kitaplık verimini nicelleştirerek yüksek kaliteli bir kitaplık ürettiğinizi doğrulayabilirsiniz.

Bazı durumlarda evet. Reaktifleri aspire etmek ve dağıtmak için pipet ipuçlarını kullanan sistemlerde otomasyonun etkinleştirilmesi için her reaktifin yeterli şekilde doldurulmasını sağladık. Reaktifleri aspire etmek ve dağıtmak için tüp kullanan bir otomasyon sisteminiz varsa, sağlanan her reaktif için yeterli olmayacaktır. Bununla birlikte, sağlanan her bir reaktifin gerçek miktarı etiketlerde listelenir ve 96 kitaplık için gereken toplam reaktif hacmini ve aşırı dolum hacmini içerir, böylece bu hacimler, reaktif miktarının sisteminiz için yeterli olup olmadığını belirlemenize yardımcı olur. Bu reaktif hacimleri otomasyon gereksinimleriniz için yeterli değilse, Lucigen Genesuz, ihtiyaçlarınızı karşılamak için özel dağıtım ve kit hakkında sizinle konuşmaktan mutluluk duyar. Lütfen bizimle iletişime geçiniz : info@genesuz.com

Çapraz kirletici örnekleri önlemek için 96 gözlü platelerde çalışırken ekstra önlem almanız önemlidir. Özellikle DNA, reaktifler eklerken ve yapışkan plate contalarını çıkarırken sıçrama, damlama ve aerosollerden kaçının. Dökülme ve hava kabarcıklarını önlemek için yapışkan plate contalarını ve pipeti dikkatli bir şekilde tekrar kullanmayın.

Çok kanallı pipetler ile çalışırken çapraz kontaminasyonu önlemek için her adımda yeni uçların kullanılması gerekir. Yeni ipuçlarını kullanmanın kritik olduğu durumlarda el kitabında açıkça belirtilmiştir, ancak emin değilseniz, yeni ipuçları kullanın. Ayrıca, rezervuardan 96 kuyucuklu bir plate’e reaktif transferleri gerçekleştirirken veya bir kuyu kümesine pipetledikten sonra uçların dışındaki damla oluşumunu önlemeye çalışın. Bu damlacıkları tabaklar boyunca taşımaktan kaçınmak istersiniz, çünkü bunlar çapraz kontaminasyona veya zayıf kütüphane hazırlıklarına yol açabilir veya hedefe fazla miktarda reaktif katılabilir. Her reaktifin dağıtılmadan önce ve dağıtıldıktan sonra pipet uçlarının görsel olarak incelenmesi, her bir ucun doğru (mümkün olduğu kadar) hacme sahip olduğunu ve uçların dışında hiçbir damlama olmadığını doğrulamak için iyi bir yaklaşımdır. Son olarak, rainin Pipet-Lite Multi Pipet’i ve ekleme / çıkarma ipuçları ve tekrarlanabilirlik kolaylığı nedeniyle ilgili ipuçlarını kullanmanızı öneririz.

Elüsyon Tamponu, esasen AMPure boncuklarından DNA’nın ayrıştırılması için kullanılan tamponlu bir çözeltidir ve bu durumda, hacmi arttırmak ve ligasyon reaksiyon tamponunu seyreltmek için ligasyondan hemen sonra eklenir, böylece daha az viskoz olur. Bu tamponun eklenmesi gerçekten PCR’den önce Yıkama Adımı ile yardımcı olur ve Ligasyon Aşaması sırasında oluşan herhangi bir adaptör dimerinin çıkarılmasına katkı sağlar.

Tüm Çift Dizileme Primerler kümesi, bir kitaplık platei kullanılıyorsa, toplam 96 kitaplığı çoğaltabilirsiniz. Her kütüphane, Çift Endekslerin eşsiz bir kombinasyonuna sahip olacaktır. Her kütüphanenin diğer kütüphanelerle 500 veya 700 seri endeksini paylaşacağını unutmayın. Çift Dizili Primerler daha az sayıda kütüphaneyi çoğaltmak için kullanılıyorsa, 8 kütüphaneyi çoğaltmak için her 700 Serisi primerler ve 12 kütüphaneyi çoğaltmak için her 500 Serisi primerler yeterli miktarda vardır.

Illumina’nın, patterned flow hücrelerine sahip cihazlarda sıralanacak kütüphaneleri havuzlamak için talimatlarını izleyin.

Amaç, her bir primerin PCR amplifikasyon plateine doğru şekilde dağıtıldığından emin olmanıza yardımcı olmaktı. Her bir primer setini farklı bir renkle yaparak, PCR plate kurulumu sırasında her birinin bir satırın veya sütunun her bir kuyusuna eklendiğini doğrulayabilirsiniz. Kullanım Kılavuzu, MA169 Şekil 3’te özetlendiği gibi, ilk olarak her bir 700 Serisi Primerleri 2.5 µL’sini 12 kanallı bir pipet kullanarak platein her bir sırasına almayı öneriyoruz. Her satır, primerlerin başarılı bir şekilde dağıtıldığını belirten maviye dönmelidir. İkinci olarak, her bir 500 Serisi Primerin (turuncu / sarı renkli) 2.5 µL’lik bir kısmını, bir kanalın her bir kolonuna 8- kanallı bir pipet kullanarak almanızı öneririz. 500 Serisi Primerler dağıtıldığı için, platein üzerindeki her kolon, 500 Serisi Primerlerin (mavi + turuncu / sarı = yeşil) başarılı bir şekilde eklenmesini gösteren yeşil renge dönmelidir.

Hayır. Boyaların dizileme işlemlerini / enstrümanlarını etkilemediğini veya üretilen verinin kalitesini düşürmediğini göstermek için kapsamlı testler yaptık. Son kütüphane temizleme ve boyut seçim adımları sırasında, boyalar çıkarılır ve bu nedenle dizileme yapmazlar. Tamamlanmamış boya çıkarılması durumunda uyumluluğun sağlanması için, PCR amplifikasyon reaksiyonlarında bulunan tüm boya konsantrasyonlarını son kütüphanelerimize ekledik ve bu örnekleri çoklu enstrümanlar üzerinde sıraladık. Denatüre edilen kütüphanedeki bu yapay olarak yüksek konsantrasyondaki boyayla bile (en kötü durum senaryosu), sıralama çalışması / enstrüman performansı veya nihai verinin verimi ve kalitesi üzerinde hiçbir etki bulamadık.

Evet. Çift Endeksli Primerlerimiz her bir tüpte sağlandığından, her iki uçta da benzersiz çift Dizili 8 kütüphaneye kadar çoğaltabilir ve çoğaltabilirsiniz. Benzersiz çift Dizili kütüphaneler üretecek çeşitli kombinasyonlar vardır. Örneğin, (8) benzersiz primer kombinasyonları: (701,501), (702,502), (703,503), (704,504), (705,505), (706,506), (707,507) ve (708,508). Bu durumda, her iki uçta benzersiz çift Dizileri ile 8 kütüphaneye kadar çoğaltabilir ve çoğaltabilirsiniz. 500 Serisi, mevcut primerleri daha fazla kullanmak için diğer 700 Serisi Astarlarla da birleştirilebilir. Örneğin, burada tamamen benzersiz çift Dizilerle oluşturulabilen ve toplanabilen iki dört kütüphane kümesi vardır. 1: (709,501), (710,502), (711,503) ve (712,504). Set 2: (709,505), (710,506), (711,507) ve (712,508). Bu üç dizi kombinasyon kombinasyonunu ayrı sıralama çalışmalarında kullanarak, NxSeq HT Dual Endeksleme Kitinde bulunan tüm primerleri kullanabilirsiniz.

Evet. Bununla birlikte, bu iki kitin birleştirilmesi durumunda, daha az reaksiyon oluşturacaksınız ve her bir kütüphane amplifikasyon reaksiyonuna bir 500 Serisi Astar ve bir 700 Serisi Astarın 2.5 µL alikuotlarını eklemeniz gerekecektir. Sağlanan hacmin sadece bir kısmını kullanırken Dizinlenmiş Primerler çapraz bulaşmayı önlemek için çok dikkatli olun; Bir seferde sadece bir tüp açın ve bir tüpü kapattıktan ve bir sonraki açmadan önce eldivenleri ideal olarak değiştirin.

Evet. Daha düşük çoğullama yapıyorsanız ve sadece tek endekslere ihtiyacınız varsa, bu kitleri kesinlikle birleştirebilirsiniz. Kitaplık hazırlığı reaktiflerinizi toplu olarak satın alarak kitaplık hazırlamanızın maliyetini azaltabilirsiniz.

Hayır. Ligasyon adımı sırasında, Evrensel Adaptörümüzü fragmentlerinizin uçlarına ekliyorsunuz. Bu adaptör, herhangi bir Dizi / barkod bilgisi veya Illumina üzerinde bu fragmentleri yakalamak için gerekli olan dizileri (P5 ve P7 bölgeleri) içermez.

NxSeq® Dual Endeksleme Primerlerinin her bir kombinasyonu ile Evrensel Adaptör ve PCR amplifikasyonu ile ligasyondan sonra, son kütüphane fragmanları tamamen çift-sarmaldır ve TruSeq HT Primerler ile yapılan Illumina kütüphaneleri ile aynı dizi yapısına sahiptir.

Evet. Son Onarımı / A-Tailing Adımından sonra, DNA fragmanları A-tailed (tek 3 ‘A ucu). Bu parçalar uyumlu bir T-ucu olan herhangi bir adaptör ile uyumludur. Barkodlu adaptörler (örn. TruSeq adaptörleri) A-kuyruklu fragmentlere bağlanabilir ve elde edilen kütüphane standart P5 / P7 primerleri ile amplifiye edilebilir. Bununla birlikte, Evrensel Adaptörümüz sınırlı miktarlarda input DNA’sı ile en yüksek ligasyon verimliliğini sağlamak için optimize edilmiştir ve diğer adaptörlerin kullanımı ligasyon verimliliğini azaltabilir ve daha düşük kaliteli kütüphaneler üretebilir. Ayrıca, diğer PCR Dizileme primerlerinin Evrensel Adaptörümüzle uyumlu olmayabilir ve tersine, diğer adaptörler NxSeq Dual Endeksleme Primer Setleri ile uyumlu olmayabilir. En iyi sonuçlar için NxSeq Dual Endeksleme Kitimizi NxSeq UltraLow ​​DNA Kütüphanesi Kiti, 96 Reaksiyonlar ile kullanmanızı öneririz.

Evet. Reaksiyonu durdurmanız gerekiyorsa, aşağıda listelenen adımları seçmenizi öneririz. Bu noktalardan birinde dururken, daima DNA’nızı -20 ° C’de saklayın. Kullanım Kılavuzunda bu duraklama noktalarına dikkat çektik. a. Mekanik makaslama sonrası. b. Ligasyon sonrası DNA’nızdan sonra ve PCR amplifikasyonundan önce. c. PCR amplifikasyon reaksiyonunu tamamladıktan ve bir sonraki PCR Temizleme adımından önce. d. PCR ile amplifiye DNA’nın tyıkanmasından sonra ve boyut seçimine başlamadan önce. e. Kütüphane hazırlığı tamamlandıktan sonra ve sıralama işlemine başlamadan önce. Ancak, son kütüphanelerin -20 ° C’de 7 günden uzun olmayan bir süre saklanmasını öneriyoruz.

Evet. Illumina Experiment Manager’da örnek bir sayfa oluştururken, açılır menüden TruSeq HT’yi seçin. D701-712 kullanın; Örnek bilgiler girilirken D501-508, bu Diziler NxSeq Dual Dizileme Kitlerinde (E.g. Lucigen 501 = Illumina D501, Lucigen 701 = Illumina D701, vb.) Aynı sayılara karşılık geldiğinden, sıralayıcılar. Hem uygun Dizi bilgilerini hem de Illumina cihazlarında sıralamak için gerekli P5 ve P7 dizilerini eklemek için Çift (veya Tek) Dizileme Primerlerimizi kullanmalısınız

Lütfen NxSeq UltraLow ​​DNA Kütüphanesi Kitindeki Ek B’ye, 96 Reaksiyon Kullanıcı Kılavuzu – MA169’a bakınız. Kullanım Kılavuzu Lucigen web sitesinde mevcuttur.

Evet. Son Onarım / A-Tailing Adımından sonra, DNA fragmentleri A-tailed (tek 3 ‘A ucu). Bu parçalar uyumlu bir T-çıkıntısı olan herhangi bir adaptör ile uyumludur. NxSeq Adaptörlerimiz (Kat. No. 14300-1, 14400-1) dahil olmak üzere barkodlu adaptörler, A-kuyruklu fragmentlere bağlanabilir ve sonuçta elde edilen kütüphaneler standart P5 / P7 primerleri ile amplifiye edilebilir. Bununla birlikte, NxSeq® UltraLow ​​Kitlerindeki Evrensel Adaptörümüz, ligasyon verimliliği için optimize edilmiştir ve diğer adaptörlerin kullanımı, ligasyon verimliliğini azaltabilir ve daha düşük kaliteli kütüphaneler oluşturabilir. Ayrıca, diğer PCR Dizileme primerlerinin Evrensel Adaptörümüzle uyumlu olmayabilir ve tersine, diğer adaptörler NxSeq® Tek Dizileme Primer Setleri ile uyumlu olmayabilir. En iyi sonuçlar için, NxSeq HT Dual Endeksleme Kitimizi NxSeq UltraLow ​​DNA Kütüphanesi Kitleri, 96 Reaksiyonları ve istenirse 12 reaksiyon kitini kullanmanızı öneririz. Evrensel Adaptörü doğrudan standart P5 / P7 PCR primerleriyle kullanmayın. Evrensel Adaptör, kitlerimizdeki endeksli primer setleri ile güçlendirilmelidir.

Evet, ancak protokol 30 bp ile 150 bp arasındaki parçalar için değiştirilmelidir. Techsupport@lucigen.com adresinden protokol rehberliği için Teknik Destek Ekibimizle irtibata geçiniz.

Boyut Seçimi protokolümüz, oda sıcaklığı AMPure XP boncukları ile optimize edilmiştir. Diğer satıcıların boncukları farklı boyutlandırma özelliklerine sahip olabilir ve kütüphane yapımında kullanılmadan önce optimize edilmelidir.

Çift boyut Seçimi, kitaplığınızın boyut aralığı / dağıtımı verimli sıralama için çok büyük olduğunda önerilir. 700 bp’den daha büyük olan kütüphane parçaları, akış hücresi üzerindeki köprü amplifikasyonu sınırlamalarından dolayı verimli bir şekilde dizilememektedir. Çift boyutlu seçim ile kütüphane boyut aralığınızı veri analizi ihtiyaçlarınıza göre ayarlayabilirsiniz. Çift boy seçimiyle ilgili talimatlar için NxSeq® UltraLow ​​Kit kılavuzundaki Ek D’ye bakın. Evet, temizleme adımı, tuzları ve proteinleri PCR reaksiyonundan uzaklaştırır. Bu “bulaşanlar” boyut seçiminden önce kaldırılmazsa, boyut seçim protokolünüz biraz daha küçük eklerle sonuçlanır.

NxSeq® Tekli Dizileme Kitleri, 1 ila 24 kütüphanenin yapımı ve toplanması için kullanılabilir. NxSeq® Dual Endeksleme Kiti, 1 ila 96 kütüphanenin oluşturulması ve havuzlanması için kullanılabilir. Tek veya çift dizinli kitaplıklara karşılık gelen doğru örnek sayfayı kullanmanız gerektiğini unutmayın.

Çoğu Illumina sıralama platformu için, tek ve çift Dizili adaptörlerin bir karışımı Illumina örnek tabakasında küçük değişiklikler ile desteklenir. Çift Dizilemenin HiSeq X Ten gibi paralel Illumina platformlarıyla uyumlu olmadığını ve tek / çift Dizi karışımının bu platformlarla kullanılamayacağını unutmayın. Tek ve çift dizinli kitaplıkları birleştirmeyle ilgili ek bilgi için lütfen Lucigen Teknik Destek ile iletişime geçin.

Bazı durumlarda, son kütüphanenizdeki Qubit ve Bioanalyzer QC, sıralama için yeterli olmayabilir. qPCR ve / veya Nano MiSeq dizileme işlemleri, istenen küme yoğunluğunu daha kesin olarak belirlemek için kullanılabilir.

Kütüphanelerinizi tamamlamak için ihtiyacınız olan tüm tüpleri önceden etiketleyin. Tüpleri bir rafa yerleştirin, böylece tüm tüpler sırayla. Numunenizi aktarmadan veya bir numuneye eklemeden önce bir tüpün kimliğini iki kez kontrol edin. Çapraz kontaminasyonu önlemek için her zaman bariyer uçlarını kullanın ve asla bir ucu tekrar kullanmayın. Mümkün olduğunda filtrelenmiş bir PCR başlığında çalışın ve her zaman PCR reaksiyonunuzu filtrelenmiş bir PCR kaputuna kurun.

Evrensel Adaptörün DNA fragmentlerinize bağlanmasından sonra, kütüphaneniz Diziler ve P5 / P7 akış hücresi bağlayıcı sekanslardan yoksun olacaktır. Sağlanan endekslenmiş primer setleri ile amplifikasyon, Dizi ve P5 / P7 flow hücresi-bağlanma dizilerini amplifiye edilmiş fragmentlere ekleyecektir. 5 döngü için amplifikasyondan sonra, kütüphaneniz parçaların ~% 94’ünde gerekli tüm dizilere sahip olacak ve 8 döngü% 99’un üzerinde tam dizileri sağlayacaktır. Dizileri ve P5 / P7 flow hücresi-bağlanma dizilerini eklemek için adaptör ile bağlanmış fragmentlerin PCR kullanılarak nasıl tamamlandığının grafiksel gösterimi için NxSeq® UltraLow ​​DNA Kütüphane Kiti, 96 Reaksiyonlar web sayfasındaki iş akışı şeklimize bakın. 75 ng başlangıç ​​giriş DNA’sı ile sadece 4 döngü PCR kullanıldığında, kütüphanenizin ~% 85 tam, sekanslanabilir fragmentleriı içereceğini unutmayın.

Evet, tavlama / uzatma aşaması için optimal aralık 68 ° C ila 72 ° C arasındadır.

Kütüphanenizdeki dizilerin kopya kopyaları, aşağıdakileri içeren çeşitli formlarda ortaya çıkabilir: 1) biyolojik çiftler; 2) PCR çiftleri; 3) optik çiftler ve 4) dışlama amplifikasyonu (ExAmp) veya yakınlık çiftleri. Birden fazla hücre / organizmadan DNA aldığınızda ve DNA örneğinizde birden fazla genom (kopya) içerdiğinde biyolojik kopyalar ortaya çıkar. Örneğin, 40 ng insan genomik DNA’sından yapılan standart bir kütüphane, her bir 300 bp ekinin 5,714 potansiyel tam kopyasına dönüşen 5,714 genom eşdeğerini içerebilirken, 40 ng E. coli K12 kütüphanesi Her 300 bp’lik ek 7.8 M’nin üzerinde tam kopya içerebilir. Böylece, genomun boyutu azaldıkça, potansiyel biyolojik çoğaltmaların sayısı aynı başlangıç ​​DNA miktarı ile artar. Her amplifikasyonda PCR çiftleri üretilir; Her amplifikasyon döngüsü, her bir molekülün başka bir kopyasını üretir. % 100 verim ile tarafsız bir sistemde (adaptör ligasyonu / PCR), PCR duplikeleri, kullanılan dizinin kapasitesini sınırlamayan yeterli başlangıç ​​DNA’sına sahipseniz, problemlere neden olmaz. Sonuçta ortaya çıkan çıktı okuma dosyalarında saptanan PCR çoğaltma hızları, aynı zamanda, şerit başına çoğullanan örnek sayısı, örnek başına analiz edilen okumaların sayısı ve kullanılan sıralayıcının kapasitesi tarafından da etkilenir. Aşağıdaki şekil bu etkilerin çoğunu göstermektedir. Bu deneyde, kütüphaneler 50 pg, 500 pg veya 75 ng E. coli genomik DNA’sından yapılmıştır. Numuneler diğer numunelerle birleştirildi ve 2 x 150 bp kimya ile bir MiSeq üzerinde çalıştırıldı. Kütüphaneye bağlı olarak 100K’dan 5.4M’ye kadar farklı sayıda okuma örneği (belirtilmiştir) ve CLC (yazılım paketi) eşlenmiş kopyalarının yüzdesi belirlenmiştir. Gösterildiği gibi, bu durumda 50 pg giriş ile bile, gözlemlenen kopyaların maksimum sayısı% 6’dır. Önemle ve beklendiği gibi, örneklenen okumaların sayısı azaldıkça, kütüphane başına kopyaların oranı da azaldı. Başlangıç ​​DNA’sının sadece 50 pg’sinden (8 genom eşdeğerinden) oluşan insan gDNA kütüphanelerinin yapılmasını ve analiz edilmesini ve ardından bir HiSeq cihazında derin dizilim yapılmasını önermiyoruz. Bu durumda, benzersiz başlangıç ​​DNA fragmentlerinin teorik sayısı, cihaz üzerindeki muhtemel kümelerin sayısından önemli ölçüde daha düşüktür. Böylece, akış hücresinin şeridini tek bir kütüphaneden (veya birkaçından) parçalarla doldurmak için, çok sayıda kopyalanmış kütüphane parçası yüklemeniz ve tespit edilen çoğaltma oranlarının çok yüksek (% 80 veya daha fazla) olması gerekir. Önemli olarak, bu kütüphanelerin kalitesi oldukça iyidir, ancak başlangıç ​​örneğindeki sınırlı sayıda benzersiz fragment ve yüksek cihaz kapasitesi nedeniyle tartışıldığı gibi yüksek tekrarlama oranı kaçınılmazdır. Bu tespit çoğaltma oranı, çoğullama ile azaltılabilir, bu da aslında kütüphane başına örneklenen okumaların sayısını azaltır (yukarıda gösterildiği gibi). Ne yazık ki, tüm PCR polimerazları ve tampon sistemleri bazı önyargı ve değişken verimliliklere sahiptir. Bu nedenle, NxSeq UltraLow ​​DNA Kütüphanesi Kitindeki gibi, en az önyargı üretmek üzere tasarlanmış bir PCR sistemi kullanmak önemlidir. PCR kopyaları ayrıca, yeterli bir DNA kullanılarak minimize edilebilir, öyle ki, bir dizi kütüphane (~ 5 döngü) üretmek için sadece çok az PCR döngüsü gereklidir. Ancak, yeterli input DNA’sına sahip değilseniz, daha fazla PCR döngüsü çalıştırmanız gerekir ve verileriniz, analizlere müdahale edebilecek sayıda çoğaltmaya sahip olacaktır. DNA giriş miktarları 25 pg ile 100 ng arasında değişen yinelenen E. coli K12 kütüphaneleri için veriler, ortalama genom kapsama alanının tüm kütüphaneler için benzer olmasına rağmen, tespit edilen kopyaların 25 pg kütüphane (% 2.5) için 250 ile karşılaştırıldığında daha yüksek olduğunu göstermektedir. MiSeq üzerinde analiz edildiğinde pg kütüphaneleri (% 0.15) ve 75 ng kitaplık (% 0.02). Optik çiftler HiSeq 2500 / MiSeq / NextSeq verileri için bir sorundur. Büyük veya düzensiz şekilli kümelerin, iki ayrı kümelenme olarak adlandırıldığı veya polimeraz kopyalamadan serbest bırakıldığında orijinal kütüphane molekülünün yeniden kümelenmesinden kaynaklanır. Exclusion Amplifikasyon (ExAmp) çiftleri HiSeqX, HiSeq 3000/4000 ve NovaSeq gibi patterned flow hücreleri kullanılarak Illumina sistemlerinde ortaya çıkar. Polimeraz kopyalamadan serbest bırakıldığında ve yakınlardaki bir kuyuya yayıldığında, orijinal kütüphane molekülü tarafından ek nanowelllerin ekilmesinden kaynaklanırlar. Bu problem, kütüphanelerin farklı insert büyüklükleri ile çoğullanması ve farklı kütüphane kitleri ile yapılmasıyla daha da şiddetlenebilir. En iyi sonuç için, yalnızca aynı kitle yapılmış benzer boyutlu ekleri olan kütüphaneleri çoğaltmanız gerekir.

Bu kopyaların çoğunluğu, olası flow hücrelerinde ExAmp küme oluşumu sırasında üretilen olası yakınlık kopyalarıdır (daha fazla bilgi için yukarıya bakınız). Bu kopyalar kütüphaneden bağımsız olarak ortaya çıkar ve şiddeti koşulardan çalışmaya değişebilir. Bunlar, bir veri kümesinden yakınlık ve optik kopyaları kaldırabilen ve ayrıca kalite gerçekleştirebilen Clumpify (https://sourceforge.net/projects/bbmap/ adresinde bulunan BBMap araç setinin bir parçası) gibi bir program kullanılarak biyoinformatik olarak kaldırılabilir, ayrıca kırpma ve adaptör filtrelemesi yapabilir.

 

Illumina dizileme platformları, kısmen parçalayıcı üzerindeki köprü büyütme verimlilikleri ve hibridizasyon kinetikleri nedeniyle daha küçük insert boyutlarına doğru eğilimlidir. Farklı insert boyutlarına sahip kütüphaneleri bir araya getirdiğinizde, daha küçük insert kütüphaneleri kümeleri daha verimli bir şekilde oluşturacak ve dolayısıyla daha büyük kütüphanelerden daha fazla dizi okuyacaktır. Tek bir kütüphane sıralanırken bile, sonuçtaki dizi daha küçük insertlere doğru eğilimlidir ve nihai haritalanmış boyut aşağıdaki Tablo l’de gösterildiği gibi giriş kütüphanesi boyutundan daha küçük olacaktır. Illumina, hazırlık aşamasından bu aşamaya kadar ki final kütüphanelerindeki farklılıklar nedeniyle bir akış hücresinin aynı şeridinde farklı kütüphane hazırlık setleri ile hazırlanan kütüphaneleri desteklemez ve bunu şiddetle tavsiye etmiyor.